Nei giorni scorsi la notizia degli erborinati a colori, complice qualche titolo che faceva riferimento diretto al Gorgonzola Dop, ha fatto molto scalpore, tanto da costringere il presidente del Consorzio di tutela, Antonio Auricchio, a precisare che no, il Gorgonzola Dop non sta per cambiare colore. “Credo che ci sia un grosso equivoco che, come Consorzio di Tutela, ci preme chiarire. Non dobbiamo fare confusione tra Gorgonzola Dop e formaggi erborinati. Il nostro Gorgonzola fa certamente parte di questa grande famiglia mondiale di formaggi, definita in inglese “blue-cheese”,ma i due termini non coincidono. La ricerca inglese secondo cui si possono produrre degli erborinati con fantasiose venature colorate, non può riguardare certo il Gorgonzola che è un prodotto Dop realizzato seguendo un rigido disciplinare di produzione che ne definisce in maniera molto precisa anche aspetto e colore”. Fin qui la precisazione del Consorzio. Ma cosa dice davvero lo studio britannico del professor Paul Dyer dell’Università di Nottingham pubblicato su Npj Science of Food, secondo cui in futuro le venature degli erborinati potranno essere di colore giallo-verde o addirittura diventare rosa o rosso-marrone? Ecco un estratto della ricerca pubblicata su Nature sugli erborinati a colori.

Erborinati a colori: la ricerca del professor Dyer

Il Penicillium roqueforti è utilizzato in tutto il mondo nella produzione di formaggi erborinati. Il colore blu-verde deriva dalle spore pigmentate formate dalla crescita dei funghi. Utilizzando una combinazione di bioinformatica, delezioni geniche mirate ed espressione genica eterologa abbiamo scoperto che la formazione del pigmento era dovuta a un percorso di biosintesi della DHN-melanina. La delezione sistematica dei geni del percorso ha alterato il colore delle spore che si formavano, producendo fenotipi dal bianco al giallo-verde fino al rosso-rosa-marrone, dimostrando il potenziale per generare nuovi ceppi colorati. Non è stato riscontrato alcun impatto consistente sulla produzione di acido micofenolico a seguito dell’interruzione del percorso, sebbene i livelli di roquefortina C fossero alterati in alcuni deletanti. È importante sottolineare che i livelli di metil-chetoni associati al sapore del formaggio blu non sono stati influenzati. Sono stati quindi generati mutanti di colore indotti dai raggi UV, consentiti nella produzione alimentare. È stata ottenuta una gamma di colori e alcuni fenotipi sono stati mappati con successo per individuare le mutazioni genetiche. Selezionati mutanti di colore sono stati successivamente utilizzati nella produzione del formaggio e hanno generato nuove colorazioni previste senza micotossine elevate, offrendo l’entusiasmante prospettiva di utilizzo nella futura produzione di formaggi erborinati a colori.

Il Penicillium roqueforti

Il Penicillium roqueforti ha un ruolo centrale nella produzione di formaggi stagionati con muffe interne come Gorgonzola, Roquefort e Stilton, dove il fungo è fondamentale per lo sviluppo del sapore e della consistenza attraverso la sua attività enzimatica. Inoltre, la sporulazione asessuata del fungo nelle cavità del formaggio dà luogo al caratteristico aspetto venato di blu, mentre i ceppi commerciali vengono venduti in parte sulla base dello sviluppo del colore. Sono state descritte variazioni sia nel colore delle spore che nella struttura delle colonie per gli isolati di tutto il mondo provenienti da substrati formaggio e non formaggio. Nonostante l’importanza del colore in P. roqueforti, la base genetica della pigmentazione delle spore in questa specie non è stata precedentemente chiarita. Nel presente studio ci siamo basati sulla conoscenza dello sviluppo del pigmento in altri funghi ascomiceti per identificare una via biosintetica DHN-melanina in P. roqueforti e abbiamo utilizzato approcci sperimentali per confermare l’attività funzionale della via. I risultati hanno inoltre dimostrato la possibilità di generare nuovi ceppi colorati tramite l’interruzione del percorso, di potenziale interesse pubblico e commerciale, che è stato ulteriormente confermato dall’uso della mutagenesi UV per indurre una gamma di mutanti di colore.

L’aspetto blu-verde dei conidi di P. roqueforti suggerisce che potrebbe essere presente una via di biosintesi della DHN-melanina simile a quella descritta per A. fumigatus. La disponibilità del genoma8 FM164 di P. roqueforti ha consentito le analisi BLAST, che hanno portato all’identificazione di una via biosintetica canonica DHN-melanina in P. roqueforti, composta da sei geni (alb1, ayg1, arp2, arp1, abr1 e abr2) il cui enzima sequenziale è stato precedentemente dimostrato che l’attività porta alla sintesi di DHN-melanina. Lo stesso insieme di geni è stato rilevato e sequenziato dall’isolato industriale 74-88 di P. roqueforti utilizzato per il lavoro sperimentale nel presente studio. Questi risultati sono coerenti con i rapporti sulla presenza di percorsi DHN-melanina nelle specie correlate di Penicillium e Aspergillus, che mostrano prove di raggruppamento genomico di geni del percorso ritenuti collegati all’evoluzione e alla regolazione del percorso. Tuttavia, P. roqueforti FM164 è unico tra le penicilia finora segnalate in quanto il gene della laccasi abr2 si trova su un super contig separato (HG792016.1) dagli altri cinque geni del percorso raggruppato, mentre c’era una distanza relativamente grande (oltre 100 kb ) tra alb1 e gli altri quattro membri del cluster principale. Tale separazione dei geni della via DHN-melanina è stata osservata anche nella Botrytis cinerea e nell’Alternaria alternata, sebbene il significato funzionale non sia chiaro.

È stata applicata una combinazione di inibizione di enzimi biochimici, espressione genica eterologa e approcci di modificazione genetica (GM) per valutare se la presunta via biosintetica DHN-melanina fosse effettivamente funzionale in P. roqueforti. Innanzitutto, sono stati utilizzati noti inibitori enzimatici della via DHN-melanina per confermare la funzione genetica. L’aggiunta degli inibitori di Arp2 triciclazolo e piroquilon ha portato alla produzione di colonie rosa-rossastre-marroni, coerenti con il fatto che arp2 è un componente chiave nella via DHN-melanina di P. roqueforti.

In secondo luogo, i primi due geni delle vie putative P. roqueforti alb1 e ayg1 sono stati espressi in un sistema di espressione eterologa di A. niger per identificare i metaboliti prodotti. I trasformanti che esprimevano alb1 cresciuti su terreni solidi hanno mostrato una conidazione ritardata del ceppo A. niger ospite, molto probabilmente a causa della produzione di alto livello e del potenziale accumulo intracellulare del naftopirone YWA1 coerente con l’aspetto giallastro del micelio. Questo effetto è stato alleviato nei trasformanti che esprimono sia alb1 che ayg1 su terreni solidi, ritenuto dovuto a una migliore secrezione del tertraidrossinaftalene rispetto a YWA1 poiché il micelio di questi ultimi ceppi appariva bianco.

Quando coltivato in coltura liquida, si è scoperto che un ceppo che esprime il gene di P. roqueforti alb1 produce l’eptaketide YWA1 e quando alb1 è stato co-espresso con P. roqueforti ayg1 è stato prodotto 1,3,6,8-THN. Questi risultati non solo hanno confermato che i geni codificano per proteine funzionali, ma hanno anche dimostrato che questi primi stadi chiave della biosintesi dei pigmenti in P. roqueforti seguono il percorso di biosintesi della DHN-melanina descritto per A. fumigatus. Si noti che la formazione del pigmento potrebbe essere attribuita esclusivamente all’espressione dei geni P. roqueforti alb1 e ayg1 perché la via endogena DHN-melanina di A. niger, inclusa la formazione del pigmento nero aspergillina, non è espressa durante la crescita liquida condizioni del test. Questo risultato è coerente con studi precedenti sull’espressione eterologa dei pigmenti di melanina fungina in Aspergillus oryzae, che utilizzavano anche un ceppo selvaggio in termini di produzione di pigmenti conidi, e non è stata osservata alcuna interferenza da parte dei pigmenti conidi di A. oryzae. Si nota inoltre che l’espressione eterologa di ulteriori elementi della via è stata considerata problematica a causa della necessità di costrutti genici multipli e della necessità di un’adeguata localizzazione cellulare degli stadi successivi della via, e pertanto non è stata perseguita.

In terzo luogo, le cassette di delezione sono state integrate con successo nel genoma per rimuovere individualmente tutti e sei i presunti geni della via DHN-melanina. La delezione del gene ha comportato un cambiamento drammatico nella pigmentazione dei conidi per ogni passaggio del percorso. La rimozione del gene alb1 ha prodotto colonie bianche (albine) con conidi privi di pigmentazione visibile, indicando la mancanza di sintesi di polichetide come descritto in altre specie di Aspergillus e Penicillium. La delezione di ayg1 ha prodotto colonie giallo-verdi, molto probabilmente a causa dell’accumulo dell’eptacide YWA1 e di altri prodotti intermedi alb1. Ciascuna delezione di arp2 e arp1 ha prodotto colonie rosso-rosa-marroni, probabilmente dovute all’accumulo di 1,3,6,8-THN e scitalone, rispettivamente. La delezione di abr1 e del gene finale della laccasi abr2 hanno entrambi prodotto colonie con una colorazione marrone, probabilmente collegata all’accumulo di vermelone o 1,8-DHN e altri intermedi della via, rispettivamente. Sebbene i risultati fossero coerenti con le relazioni precedenti e gli studi sull’espressione eterologa, la conferma dei presunti intermedi chimici richiederà ulteriore lavoro biochimico. In effetti, la cancellazione di geni nella via biosintetica della DHN-melanina può portare a diversi sottoprodotti di percorsi alternativi, come quelli formati dall’autoossidazione piuttosto che dalla sola azione enzimatica. Per confermare ulteriormente la funzione genetica, sono stati intrapresi studi di complementazione con i geni polichetide sintasi (alb1) e laccasi (abr2) come rappresentanti all’inizio e alla fine del percorso DHN-melanina. In entrambi i casi, il salvataggio con il gene parentale ha ripristinato la pigmentazione conidica di tipo selvaggio nei ceppi complementati.

Erborinati a colori: micotossine e aromi volatili

Ci si è resi conto che la capacità di produrre ceppi derivati del colore di P. roqueforti attraverso l’interruzione del percorso biosintetico dei pigmenti ha fornito l’entusiasmante possibilità di produrre nuovi ceppi commerciali del fungo con colori delle spore alternativi anziché solo la tradizionale colorazione blu-verde. Tuttavia, era importante comprendere ogni possibile impatto dell’interruzione del percorso DHN-melanina sulla fisiologia di tali mutanti di colore. Pertanto, sono stati intrapresi studi per valutare l’impatto sui livelli di micotossine e sulla produzione di aromi volatili nei vari ceppi di delezione genetica.

Per quanto riguarda le micotossine, è stato studiato l’impatto sull’acido micofenolico (MPA) e sulla roquefortina C come due metaboliti secondari chiave che destano preoccupazione per la sicurezza. Non è stato riscontrato alcun aumento significativo nella produzione di MPA tra i ceppi parentali 74-88 e quelli con delezione del gene. Forse sorprendentemente, è stato osservato un aumento significativo della produzione di roquefortina C in molti ceppi di delezione del gene, in particolare in un ca. triplicato aumento del ceppo Δayg1. Le ragioni di questo aumento non erano chiare dato che la regolazione delle vie dei metaboliti secondari è complessa. È stato recentemente dimostrato in Alternaria alternata che la via biosintetica per la produzione di altertossine utilizza molti degli enzimi della via DHN-melanina, indicando questa via come fonte per la produzione di tossine fungine. Nonostante l’aumento dei livelli di roquefortina C osservato in alcuni deleti del gene DHN-melanina, è importante notare che i livelli sono rimasti ancora relativamente bassi e della stessa entità complessiva del ceppo di produzione. Inoltre, la produzione è stata indotta dalla presenza di saccarosio, assente durante la produzione del formaggio. Anche altri fattori abiotici come la temperatura, la concentrazione di NaCl e il pH possono influenzare la produzione di micotossine in P. roqueforti.

Per quanto riguarda la produzione di volatili, è stato studiato l’impatto della delezione genetica su 26 diversi composti aromatici associati alla maturazione e allo sviluppo dell’aroma nel formaggio erborinato. Nessun cambiamento significativo nei livelli di chetones, associato principalmente al sapore di formaggio blu, è stato osservato in tutti i ceppi di delezione. Al contrario, in tutti i ceppi di delezione sono stati riscontrati livelli più bassi di alcuni esteri e 2-alcoli. Le ragioni di questi livelli più bassi non erano chiare, anche se si ipotizza che ciò possa essere dovuto all’accumulo di intermedi del percorso. I risultati suggeriscono quindi che i mutanti della via DHN-melanina di P. roqueforti potrebbero avere profili aromatici leggermente alterati se utilizzati nella produzione di formaggio, pur mantenendo il sapore chiave del “formaggio blu”. Tuttavia, si avverte che il presente studio ha utilizzato un sistema di latte modello per la produzione volatile e i risultati non possono essere estrapolati direttamente alla produzione di formaggio intero. Altrove è stata segnalata una grande variazione nella produzione di aromi volatili tra gli isolati di P. roqueforti.

I pigmenti mutanti

Incoraggiati da questi risultati, abbiamo quindi studiato se fosse possibile creare pigmenti mutanti di P. roqueforti mediante mutagenesi UV classica, dato che non è possibile utilizzare ceppi GM nella produzione commerciale di formaggio secondo l’attuale legislazione alimentare, ma i derivati ​​UV sono consentiti. Infatti, un ceppo di P. roqueforti a spore bianche derivato dai raggi UV è stato precedentemente commercializzato. Una serie di mutanti di colore sono stati prodotti con successo in seguito all’irradiazione UV della produzione 74-88 o dei ceppi derivati dalle ascospore B20 e A22. Per la maggior parte dei mutanti di colore, si è scoperto che quelle che producono colonie con un particolare fenotipo di colore non standard contengono mutazioni indotte dai raggi UV nel gene corrispondente nella via DHN-melanina. Ad esempio, il mutante di colore bruno-rossastro 74-88-1 aveva una mutazione nel gene arp2 (T290A), il mutante verde 74-88-5 aveva una mutazione nel gene ayg1 (L258P) e il mutante bianco (albino) il mutante B20-1 aveva una mutazione nel gene alb1 (L102S). Tuttavia, è interessante notare che la tonalità e la profondità del colore dei mutanti UV a volte differivano leggermente dal rispettivo ceppo delente del gene intero. Ciò ha suggerito che alcuni dei geni mutati nei raggi UV potrebbero ancora produrre un prodotto proteico con funzionalità parziale, sebbene l’impatto delle mutazioni UV in altre parti del genoma non possa essere escluso. Inoltre, sono stati prodotti alcuni mutanti di colore (ad esempio, verde grigiastro e blu intenso) per i quali non è stata trovata alcuna mutazione in nessuna delle regioni codificanti dei geni della via DHN-melanina. Ciò indica che elementi nella regione del promotore e/o elementi genetici diversi dalla via DHN-melanina possono mediare la produzione di pigmenti e il colore in P. roqueforti. Pertanto, la mutagenesi UV potrebbe consentire la generazione di uno spettro più ampio di ceppi di colore rispetto alla sola delezione del gene della via DHN-melanina mirata. Si noti che percorsi leggermente diversi per la sintesi della DHN-melanina sono stati riportati per Aspergillus nidulans e Aspergillus flavus e che un percorso biosintetico della melanina non canonico è stato descritto da A. terreus, così come la sintesi della piomelanina in A. fumigatus.

Alcuni mutanti derivati del colore sono stati poi utilizzati come colture starter nella produzione del formaggio. I formaggi così ottenuti hanno infatti mostrato notevoli differenze nel colore delle venature del formaggio rispetto al ceppo parentale. I livelli di micotossine prodotte nei formaggi dai derivati del colore erano paragonabili o inferiori a quelli prodotti dagli isolati parentali, indicando un probabile utilizzo sicuro per la produzione alimentare, anche se questa scoperta richiederà conferma con un numero maggiore di ceppi. Ciò era coerente anche con i risultati della produzione di micotossine su terreni che inducono saccarosio da parte di mutanti di colore UV rappresentativi, dove i livelli erano paragonabili o inferiori al ceppo di produzione, indicando ancora una volta un uso sicuro per la produzione alimentare. Va notato che le micotossine sono state precedentemente segnalate nei formaggi erborinati, ma i livelli prodotti non sono considerati un rischio per la salute e le micotossine potrebbero essere instabili nella matrice del formaggio. Tuttavia, si avverte che P. roqueforti può produrre ulteriori micotossine, che non sono state esaminate nel presente studio.

Sebbene P. roqueforti sia meglio conosciuta per le applicazioni nella produzione del formaggio, la specie è una muffa saprofita relativamente comune che si trova su vari substrati naturali. Pertanto, la presenza del pigmento DHN-melanina nella parete delle spore può essere spiegata in parte dal fatto che la melanina può fornire protezione contro le radiazioni UV ambientali. In effetti, abbiamo scoperto che la cancellazione di geni rappresentativi dalla via biosintetica della DHN-melanina (Δalb1, Δayg1 e Δarp1) ha comportato una sopravvivenza delle spore significativamente inferiore rispetto a quelle dell’isolato parentale 74-88 quando esposto allo stress UV, coerente con risultati paralleli sui conidi carenti di melanina di P. roqueforti esposti a radiazioni UV. Inoltre, le melanine fungine possono conferire protezione contro lo stress ossidativo e termico e sono necessarie come componenti strutturali per il corretto assemblaggio della parete cellulare fungina.

Erborinati a colori: le conclusioni di Dyer

Per concludere, il lavoro presentato in questo studio ha rivelato la principale via del pigmento utilizzata da P. roqueforti per la produzione di DHN-melanina, in coinvolgendo un insieme canonico di sei geni (alb1, ayg1, arp2, arp1, abr1 e abr2), la maggior parte dei quali erano raggruppati insieme nel genoma. L’interruzione dei geni del percorso mediante delezione genetica o mutagenesi UV ha portato a ceppi che producono spore con pigmentazione alterata. Tali ceppi potrebbero essere di interesse pubblico e commerciale per la produzione di nuovi formaggi stagionati con muffe di colore “non blu” e rappresentano un ulteriore passo avanti nell’addomesticamento della specie. L’accettazione del mercato rivelerà il futuro di tali prodotti. Studi UV hanno indicato che ulteriori elementi genetici diversi dalla sola via DHN-melanina possono anche mediare la produzione di pigmenti e il colore in P. roqueforti. Si prevede che il futuro sequenziamento del genoma di tali mutanti di colore non standard di P. roqueforti fornirà approfondimenti su ulteriori percorsi dei pigmenti.

Il presente studio ha inoltre scoperto che la cancellazione di alcuni geni della via DHN-melanina di P. roqueforti ha comportato cambiamenti inaspettati sia nella produzione della micotossina roquefortina C sia anche in alcuni composti volatili aromatici. Ciò richiede ulteriore lavoro per studiare i collegamenti tra la biosintesi della DHN-melanina e altri processi cellulari.